REPRODUCCIÓN SIN MUJERES

martes 6 de abril de 2010

¿COMO CONVERTIR UN OVULO EN ESPERMATOZOIDE? ANALISIS BIBLIOGRAFICO SOBRE LA EPIGENETICA DE LOS GAMETOS

Blgo. Luis Arbaiza

Biólogo con mención en genética Universidad Nacional Mayor de San Marcos.


1.- INTRODUCCION

Un espermatozoide y un ovulo son genéticamente iguales, lo que permitiría, teóricamente, usar las técnicas de fertilización asistida (en especial el ICSI-inyección intra-citoplasmática) para logar la fertilidad y la paternidad biológica con gametos de un mismo tipo (dos óvulos o dos espermatozoides)
Pero a pesar de su igualdad genética, ovulo y espermatozoide son diferentes epi-genéticamente.
Esta diferencia epigenética de los gametos se llama imprinting. Habiendo un imprinting materno y otro paterno.
La unión de dos gametos, uno con imprinting materno y otro paterno permite el desarrollo normal del embrión.
La unión de gametos con el mismo imprinting lleva a diversos defectos epigenéticos y hace inviable el desarrollo embrionario.

Convertir el imprinting paterno de un espermatozoide en materno in Vitro podrá permitir convertir, epigeneticamente hablando, un espermatozoide en ovulo, con lo que será perfectamente posible la paternidad biológica con este material genético.

Pero ¿de que se trata esta diferencia epigenética y que la causa?
Aun no se puede responde por completo a esta pregunta.
La motivación de esta investigación bibliográfica es descubrirlo.

2.- ¿QUÉ ES EL IMPRINTING?
Un gen puede estar prendido o apagado. Hay un cierto número de
genes que están prendido en los espermatozoides y apagado en los óvulos. Estos genes son los que intervienen en el imprinting.
Así, óvulos y espermatozoides tienen los mismos genes pero no están activos los mismos en ellos. Y esto los hace funcionalmente diferentes.
El encendidos o apagado que da origen al imprinting masculino o femenino es un patrón especifico y constante que ocurre en la gametogénesis.
Cuantos y cuales genes intervienen en el imprinting es algo que se sabe solo parcialmente.

JUSTIFICACION
1.- La impronta genética es un requisito para el desarrollo normal de los embriones
Esta se realiza en la línea germinal
Su error debe llevar errores que impiden el desarrollo exitoso de los embriones.
En especial en aquellos procedimientos como el ICSI que aceleran los procesos epignéticos en el gameto masculino.
Se ha demostrado mayor porcentaje de enfermedades epigenéticas en paciente de niños de ICSI
Se han encontradon defectos en la methylation de H19 y MEST EN OLIGOZOSPERMICOS (C.J. Marques 2008) Esto podría explicar la aparición del Silver–Russell syndrome en niños con H19 hypomethylation nacidos de ART. (C.J. Marques 2008)
Ademas una baja unmethylation of the CTCF-binding site could lead to inactivation of the paternal IGF2 gene, and be linked to decreased embryo quality and birth weight, often associated with ART. (C.J. Marques 2008)
2.- Imrpinting es un límite a la clonación pues no hay tiempo de un correcto reprogramación
3.- nuevos medicamentos
4.- ingeniería epigenética

3.- DELIMITACION DEL PROBLEMA
Aquí caben varias preguntas, aun sin una completa respuesta:
3,1 ¿Qué genes son estos?
3.2 ¿Cuándo se modifican?
3.3 ¿Quien los modifica?
3,4 ¿como los modifica?
3.5 ¿Cual es la causa no causada del imprinting? ¿Es genética o epigenética?
3.6¿Cuál es la relación con el gen Sry que obviamente es el única diferencia entre genoma masculino y femenino y ah de ser el punto de partida de esta diferenciación?

MATERIALES Y MÉTODOS
Se analizo la bibliografía existente en temas relacionados para intentar responder las preguntas de la investigación
Para lo que se accedió a bibliotecas virtuales
Y a programas informáticos de manejo de data.

RESULTADOS
ANALISIS BIBLIOGRAFICO DE LAS PREGUNTAS

3,1 ¿QUÉ GENES SON ESTOS? GENES INVOLUCRADOS EN EL IMPRINTING
Hay un genoma del imprinting unos 156 posibles nuevos genes, y el status de imprinting-gene puede ser predicho por su secuencia (Luedi, P.P. et al. (2007). El mecanismo clásico de impronta genética de un gen es la metilación pero no es el único y no necesariamente significa inactivación.
Aquí una relación de algunos genes conocidos como involucrados en el imprinting humano.

Cromosoma ubicación GEN Estado en el espermatozoide Estado en el ovulo Activador función
1 NOEY2
activo (supresor de tumores)
IGF2 activo Control independiente de los demas, su cambio arrastra numerosos genes más
7p12 (GRB10) in growth factor receptor protein 10
7 q21 PEG10 inactivó activo Quizás sea un nuevo gen para imprinting


7q31.3 MEST isoformas 1 and 2,
8 KCNK9 (activo en el cerebro causa cancer, bipolar y epilepcia)
8p23 DLGAP2 (posible supresor de tumores de vejiga)
DLGAP2
associated protein-2 (Dlgap2).
was excluded as the gene responsible for EPMR.
11 H19
inactivo activo Rna no codificante
Rol en cancer
a member of the AP2 transcription factor family

E2F1 transcription factor

Posiblemente uan control diferente a los de los demas
Su cambio arrastar otros genes mas

11 p57, Kip2 CDKN1C
activo
14 q MEG3,
15 q11-q13 SNRPN activo (ribonucleoproteína nuclear pequeña, polipéptido N)
15 q11-q13 IPW No polypeptide
functions RNA.
predominantly in brain
15 UBE3A causes Angelman syndrome. on the mother's chromosome
19q13.4 Possible llave maestra
X XIST activo
inactivo
Idice que esa metilacion se remueve en la spermatogenesis Xist(es en raton)

NESP55
ATP10A
PHLDA2
NDN
MAGEL2
SNRPN inactivo
PEG3
KCNQ1
KCNQ1OT1
CDKN1C
TP73
IGF2R
WT1
SLC22A18




3.2 ¿CUÁNDO OCURRE EL IMPRINTING?

Durante el desarrollo de células germinales primordiales el patrón de imprinting se borra. Probablemente al entrar a la gónada.
En la espermatogenesis se completa en la fase haploide (meiosis) en el hombre ocurre antes de la meiosis la paterna tan pronto como cuando proliferan las espermatogonias, según algunos autores es intrinseca y cell-autonomous.
En la ovogénesis el imprinting ocurre en ocytes alrededor del tiempo de e la primera división meiotica, la metilacion en la mujer ocurre en el desarrollo post natal cuando los ooccitos están en diploteno prophase I, el imprinting materno en continuamente establecido en la maduración del oocytes.
Pero la metilación puede ser en diferentes momentos para diferentes genes (Paolini 2004)
Se ha comprobado que no se debe a la influencia de las células somáticas de la cresta genital o el ambiente de la gónada en las células primordiales. (Paolini 2004)

ESPERMATOGENESIS

Tiempo ETAPA TIEMPO FOTO ESATDO DEL IMPRINTING
0 ZYGOTO

SE EXAGERA LA DIFERENCAI DEL IMPRINTING
La metilación paterna se desmetila brevemente después de la fertilización, y la materna sufre metilaciones de novo
4 horas
En ratón el pronucleo paterno es desmetilado dentro de las 4 horas posteriores a la fertilización

4 horas

Una desmetilacion global ocurre en la morula a las 4 h de fertilización.


5 días
En el blastocisto reestablece la metilación en la inner cell mass pero no en el trophectoderm. En el blastocisto se reestablesce la metilación en la inner cell mass pero no en el trophectoderm. ( Kierszenbaum AL. 2002)


3-4 semanas Primordial germ cells as PGCs Tienen imprinting materno-paterno migran Las Primordial germ cells heredan un imprinting bialelico de padre y madre, y borran su imprinting para empezar uno de novo durante la gametogenesis. ( Kierszenbaum AL. 2002)
Las células germinales primordiales expresan estos genes: Blimp1, Oct3/4, Fragilis, Stella, c-Kit, Mvh, Dazl and Gcna1 (Deshira Saiti 2000)


H19 y Igf2 se expresan en endodermo y mesodermo, (Andrea L. Webber1 1998)

6 semana Embrionic germ cells
No tienen imprinting o esta desregulado, ya están en gónada

40 células primordiales se destinan a ser gónada inducidos por tejidos exra-embrionarios Se hipotetiza que esa celulas reprimen el programa de somatización
Blimp1 (o Prdm1), que es un represor de tarscripcion ayuda a esa fundación (Yasuhide Ohinat 2005 )

al nacer y en unos meses Se completa el imprinting paterno
pubertad Inicio de esperamatogenesis. La paternalisacion es un proceso continuo en las mitotically-dividing spermatogonial stem cell y meiotically-dividing spermatocyte progeny derivada ( Kierszenbaum AL. 2002)

Dnmt3L, y Dnmt3b, interactúan con Dnmt2a y Dnmt3b y es requerida para una correcta espermatogenesis. ( Kierszenbaum AL. 2002)

El imprinting ya esta maduro en las stem cell en las línea germinal (C.J. Marques 2008)

Spermatogonia son germ cells inmaduras hacen mitosis
Algunas se diferencian hasta primary spermatocytes.
Despues de la primera meiosis se vuelven 2 secondary spermatocytes


Estos hacen meiosis 2 y forman 2 espermatidas





Espermatogonia (diploide) Estas en speramtozoides ya esta metilado H19

3.4 ¿QUIEN LOS MODIFICA?

Los genes a improntar generalmente son metilados en su promotor (la metilación es la incorporación de un grupo metil en un carbón del nucleótido)



Los promotores son ricos en islas CpG
5-Methylcytosine se produce al reaccionar DNA methyltransferases (DNMT 1, 3a or 3b), que cataliza la transferencia de un grupo metilo (CH3) desde S-adenosylmethionine (SAM) al carbón 5 de la citosina
Estas islas metilada son susceptibles de ligarse a proteínas ( por ejemplo MECP2 "methyl CpG-binding protein 2 )
Dnmt3a y Dnmt3b dan metilaciones de novo
Dnmt1 al dividirse el dna produce una nueva metilación en la hebra hija
La Demethylation ocurre en ausencia de Dnmt1 with continued rounds of DNA replication (passive demethylation), as well as actively (without DNA replication). The nature of demethylases is unknown.
DNMT3L asiste a las metilaciones de novo
Entre el 60 y 90% de las cpg se metilan (cosa rara los de imprintin son pocos)
La metilación la hacen DNMT1, DNMT3a, DNMT3b DNMT3a y DNMT3b parecen ser las que dan patrones de metilacion en el embrion temprano
DNMT1 es la que mantiene ese patrón de célula madre a hija (ambas copias)
La metilación no siempre es silenciamiento
La metilación cambia estructura de cromatina
Un patrón de metilación es el resultado de:
1.- d e novo metilaciones
2.- mantenimiento
3.- desmetilacion
(Paolini 2004)
En general los genes expresados en el imprinting paterno elevan el desarrollo fetal mientras que la maternal lo limita.
(Paolini 2004)
MASH2 regula el desarrollo de spongiotrophoblast
Igf2 se ha encontrado en labyrinthine trophoblast
ASCL2 se expresa en spongiotrophoblast y labyrinthine

3.5¿CUAL ES LA CAUSA NO CAUSADA DEL IMPRINTING?
La expresion del gen KCNQ1OT1 del cromosoma 11p15.5, es esencial para el imprinting de ciertas regiones. El mecanismo puede ser un gen se activa en un entorno digamos ovárico o espermático y este produce el imprinting en cascada en otro genes.
Estudiando sus factores de transcricion se podría lograr saber cual la causa primera del imprinting
IGF2
H19
19q13.4
IGF2

H19
19q13.4
La ergenic germline-derived differentially methylated region (IG-DMR) ES CANDIDATOPARA REGION CONTROL DEL CROMOSOMA 12
Es un cluster que contiene:
paternally expressed protein-coding genes Dlk1 y Dio3 y varios non-coding RNAs, de expression maternal incluido Gtl2 y C/D snoRNAs.
A retrotransposon-like gene (Rtl1) is expressed from the paternal chromosome and has an antisense transcript expressed from the maternal chromosome containing two microRNAs with full complementarity to Rtl1

Delección de IG-DMR del cromosoma materno causa la perdida del imprinting en todos los genes del cluster
La delección paterna deja intacto el imprinting
Unas mujeres carecen de un pedazo de cromosoma: 19q13.4 y su patrón de imprinting en sus óvulos es paterno

EXPERIMENTO DE 2 MADRES

El CIGOTO lo hicieron con un genoma maduro y otro inmaduro (Tomohiro Kono 2004) El oocito no desarrollado era de un raton mutante con una deleccion de 13-kilobases
La metilacion materna ocurre en la maduracion del oocito
El no desarrollado es (ng)
Y el desarrollado (fg)
Pero en el ng no se altero H19 y Igf2
Para bloquear H19 en ng se uso un ratón con una deleción en ese gen
Los embriones nacieron a los 17.5 dias
Se confirmo que estos embriones no pasan del día 17.5
Los 2 nacieron con crecimiento retardado tenían un hígado poco desarrollado
Igf2 y H19 Así como Dlk1 y Gtl2 Son impresos en la espermatogenesis.

MODIFICACION ARTIFICIAL DEL IMPRINTING
synthetic estrogen, diethylstilbestrol (DES) can developmentally imprint genes by changing the pattern of DNA methylation.( John A. McLachlan, 2001)
La exreecion de los genes impresos y el desarrollo del feto es influenciada por la adición de suero fetal de ternera al medio de cultivo (Paolini 2004)
No se sabe como este medio afecta el imprinting
Quizas remueve los grupos metilos, llevando a incompletar o a borrar el patrón de imprinting. (Paolini 2004)


ICSI E IMPRINTING
Los hijos del ICSI pesan menos (Paolini 2004)

EXPERIMENTO DEL ESPERMATOZOIDE FEMENINO
Primero Células madre se convirtieron en espermatozoides que preñaron
(Nayernia K 2006)
Células de medula se trasformaron en células germinales masculinas hubo expresión de marcadores de células germinales (Nayernia K. 2007)
El ratón nacido tenia defectos y se usos químicos especiales y vitaminas

MUJER PRODUCTORA DE ESPERMATOZOIDES
Hay un locus para molas 19q13.4. Examinaron la metilación en las hijas y en la mola
Usaron los dos bisulfite-based methods(¿??)
La mutación se heredo del abuelo o la abuelo materno por lo que se concluye que el error no se debe a un borrada de las marcas de imprinting si no mas bien al reestablecimiento de marcas maternas en la ovogénesis o en su post-cigotic mantenimiento (El-Maarri O 2003)

DISCUSIÓN
Hay al parecer dos mecanismos locomotora de los que depende el imprinting esos mecanismos deben estar relacionados a la presencia o ausencia del gen SRY aunque dicha relación aún es nebulosa.
Se conoce que algunas enzima son responsables de metilar los genes a improntar, además que estos genes son ricos en islas CpG pero dado que en un gameto son metilados y en otro no, siendo iguales cabe preguntarse ¿como sabe esa enzima que genes metilar y cuales no? Y además como sabe cuando metilar si esta en un espermatozoide o en un ovulo. Algo además de estas enzimas señalaría una diferenta o activa estas enzimas

El mecanismo puede ser un gen se activa en un entorno digamos ovárico o espermático y este produce el imprinting en cascada en otro genes.
Otra pregunta que surge de este análisis es ¿Hay polimorfismos en los imprinting genes?)
Se debería estudiar lo abortos de icsi y de art para ver como están epigeneticamente al alterar estas técnicas la normal maduración del imprinting en los gametos. Ya hay evidencia de una mayor taza enfermedades epigeneticas en ARTs
Delección de IG-DMR del cromosoma materno causa la perdida del imprinting en todos los genes del cluster lo que lo señala como un gen locomotora de imprinting.
La delección paterna deja intacto el imprinting
Unas mujeres carecen de un pedazo de cromosoma: 19q13.4
Ese gen sano feminizaría óvulos. Podría feminizar los espermatozoides
H19 y Igf2, al parecer, son impresos por un mecanismo independiente de este.
Si se logra la expresión correcta de igf2 y de ha19 un numero amplio de otros genes se pone bien (ósea de materno pasa a paterno)
Del experimento de las ratones con dos madres se puede deducir las siguientes cosas:

-Se puede concluir que un ovocito inmaduro es como un espermatozoide excepto por 2 genes (igf2 y h19)
-Se anulo uno de ellos (h19)para conseguir el espermatozoide
-por lo tanto un espermatozoide es como un ovocito inmaduro excepto por 2 genes
-Si se agrega los factores de maduración del ovulo y se anula igf2 podría convertir un espermatozoide en ovulo.

Al parecer pesan menos ivf, eso habla de que ganan los genes maternos osea que los genes paternos están incompletos
MUJERES PRODUCTORAS MDE ESPERMATOZOIDES
Si hay una mutación que convierte el genoma materno en paterno:
1.- Un elemento simple determina la paternidad o maternidad del genoma
2.-ese gen sano feminizaría los espermatozoides.
3.- la partenisación del genoma requiere la no activación o la supresión de ese gen o factor.
El estado normal quizás es paterno
Primero hay que borrar y después imprimir
Podemos hipotetizar que el factor de desarrollo folicular además de un silenciamiento del gen igf2 puede cambiar el imprinting paterno de los espermatozoides a materno

CONCLUSION
Existen dos mecanismos que inicia la cascada de eventos que llevan al patrón de imprinting paterno o materno.
Un gen en 19q13.4 es responsable de feminizaría un número muy significativo de genes a imprimir
Y otro alteraría H19 y Igf2
Agradecimientos


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