¿COMO CONVERTIR UN ESPERMATOZOIDE EN OVULO?

¿COMO CONVERTIR UN ESPERMATOZOIDE EN OVULO?
Luis Arbaiza Escalante
Biólogo con mención en genética
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
http://luisarbaizaescalante.blogspot.com/

1.- INTRODUCCION

Un espermatozoide y un ovulo son genéticamente iguales, lo que permitiría teóricamente, usar las técnicas de fertilización asistida (en especial el ICSI-inyección intracitoplasmatica) para logar la fertilidad y la paternidad biológica entre personas del mismo sexo.
Pero a pesar de su igualdad genética, ovulo y espermatozoide son diferentes epigeneticamente.
Resolver in Vitro esta diferencia podría permitir convertir un espermatozoide en ovulo y viceversa, con lo que seria perfectamente posible la paternidad biológica entre personas del mismo sexo.
Pero ¿de que se trata esta diferencia epigenética?

2.- ¿QUÉ ES EL IMPRINTING?

Hay varios tipos de fenómenos epigenéticos, en cuanto a los gametos, este esta centrado en el llamado imprinting. Que significa que un determinado numero de genes son encendidos o pagados siguiendo un patrón especifico en la gametogénesis, de modo que ciertos genes encendidos en los espermatozoides están apagados en los óvulos y viceversa


3.- ANTECEDENTES DEL PROBLEMA
Aquí caben varias preguntas, aun sin una completa respuesta (si alguna), pero las preguntas sobre la naturaleza, sin respuesta, son la razón de que exista ciencia y científicos, a la sazón son estas:
3,1 ¿Qué genes son estos?
3.2 ¿Cuándo se modifican?
3.3 ¿Quien los modifica y como?
3.4 ¿Cómo sabe e organismo que genes modificar y cuales no?
3.5 ¿Hay una llave maestra o cada uno obedece a un fenómeno independiente?
3.6 ¿Cual es la causa no causada del imprinting? ¿Es genética o epigenetica?

La naturaleza tiene la costumbre de ser abrumadoramente complicada, hay aun un largo camino de investigación científica que recorrer antes de que nazca el primer niño con 2 padres o con dos madres.

3,1 ¿Qué genes son estos?

GENES INVOLUCRADOS EN EL IMPRINTING

Hay un genoma del imprinting unos 156 posibles nuevos genes,
el status de imprinting gene puede ser predicho por su secuencia (Luedi, P.P. et al. (2007)



cromosoma region GEN ¿Que es y que hace? Estado en el esperamtoxzoide Estado en el ovulo Activador represor
1 NOEY2
(supresor de tumores) Materna
IGF2 Materna Control independiete de los delas estraño su cambio arrastar numerosos genes mas
7 7p12 (GRB10) in growth factor receptor protein 10
7 q21 PEG10 Quizas sea un Nuevo gen para imprinting
Expresión materna Metialdo en Maternal

7 7q31.3 MEST isoforms 1 and 2,


8 KCNK9 (activo en el cerebro caus cancer, bipolar y epilepcia)
8 8p23 DLGAP2 (posible supresor de tumores de vejiga)
DLGAP2
associated protein-2 (Dlgap2).

was excluded as the gene responsible for EPMR.
11 H19
Rna no codificante
Rol en cancer
Materna a member of the AP2 transcription factor family

E2F1 transcription factor

Posiblemente uan control diferente a los de los demas
Su cambio arrastar otros genes mas

11 p57, Kip2 CDKN1C
Marerna

14 q MEG3,
15 q11-q13 SNRPN (ribonucleoproteína nuclear pequeña, polipéptido N) Materna
15 q11-q13 IPW No polypeptide

functions RNA.

predominantly in brain.

15 UBE3A causes Angelman syndrome. ) on the mother's chromosome
cromosoma region GEN ¿Que es y que hace? Estado en el esperamtoxzoide Estado en el ovulo Activador represor

19 19q13.4 Possible llave maestra
X XIST Xist(es en raton)


.
activo en el esperamtopzoide Activo significa no modificado en CpG loci cerca de 5´
inactivo en el ovulo. En el ovulo ese sito esta mertilado en el ocito
Idice que esa metilacion se remueve en la spermatogenesis



NESP55
ATP10A
PHLDA2
NDN
MAGEL2
SNRPN Paterna
PEG3
KCNQ1
KCNQ1OT1
CDKN1C
TP73
IGF2R
WT1
SLC22A18




3.2 ¿CUÁNDO OCURRE EL IMPRINTING?
Durante el desarrollo de células germinales primordiales el patrón de imprinting se borra. Probablemente al entrar a la gónada
En la espermatogenesis se completa en la fase haploide (meiosis) en el hombre ocurre antes de la meiosis la paterna tan pronto como cuando proliferan las espermatogonias, según algunos autores es intrinseca y cell-autonomous.



En la ovogénesis el imprinting ocurre en ocytes alrededor del tiempo de e la primera división meiotica, la metilacion en la mujer ocurre en el desarrollo post natal cuando los ooccitos están en diploteno prophase I, el imprinting materno en continuamente establecido en la maduración del oocytes.

Pero la metilación puede ser en diferentes momentos para diferentes genes (Paolini 2004)

Se ha comprobado que no se debe a la influencia de las células somáticas de la cresta genital o el ambiente de la gónada en las células primordiales. (Paolini 2004)

Espermatogenesis

Tiempo ETAPA TIEMPO FOTO ESATDO DEL IMPRINTING
0 ZYGOTO

SE EXAGERA LA DIFERENCAI DEL IMPRINTING
La metilación paterna se desmetila brevemente después de la fertilización, y la materna sufre mutilaciones de novo
4 horas
En ratón el pronucleo paterno es desmetilado dentro de las 4 horas posteriores a la fertilización

4 horas



Una desmetilacion global ocurre en la morula a las 4 h de fertilización.


5 días
En el blastocisto reestablece la metilación en la inner cell mass pero no en el trophectoderm. En el blastocisto se reestablesce la metilación en la inner cell mass pero no en el trophectoderm. ( Kierszenbaum AL. 2002)


3-4 semanas Primordial germ cells as PGCs Tienen imprinting materno-paterno migran Las Primordial germ cells heredan un imprinting bialelico de padre y madre, y borran su imprinting para empezar uno de novo durante la gametogenesis. ( Kierszenbaum AL. 2002)
Las células germinales primordiales expresan estos genes: Blimp1, Oct3/4, Fragilis, Stella, c-Kit, Mvh, Dazl and Gcna1 (Deshira Saiti 2000)


H19 y Igf2 se expresan en endodermo y mesodermo, (
Andrea L. Webber1 1998)

6 semana Embrionic germ cells
No tienen imprinting o esta desregulado ya están en gónada

40 células primordiales se destinan a ser gónada inducidos por tejidos exra-embrionarios Se hipotetiza que esa celulas reprimen el programa de somatización
Blimp1 (o Prdm1), que es un represor de tarscripcion ayuda a esa fundación (Yasuhide Ohinat 2005 )

al nacer y en unos meses Se completa el imprinting paterno
puvertad Inicio ds esperamtogenesis La paternalisacion es un proceso continuo en las mitotically-dividing spermatogonial stem cell y meiotically-dividing spermatocyte progeny derivada
( Kierszenbaum AL. 2002)

Dnmt3L, y Dnmt3b, interactúan con Dnmt2a y Dnmt3b y es requerida para una correcta espermatogenesis. ( Kierszenbaum AL. 2002)

El imprinting ya esta maduro en las stem cell en las linea germinal (C.J. Marques 2008)

Spermatogonia son germ cells inamduras hacen mitosis
Algunas se diferencian hasta primary spermatocytes.
Despue de pa primera meiosos se vuelven 2 secondary spermatocytes


Estos hacen meiosis 2 y forman 2 espermatidas

Esperamtogonia (diploide) Estas en speramtozoides ya esta metilado H19



3.3 ¿QUIEN LOS MODIFICA Y COMO?

SE METILA EL PROMOTOR (la metilación es la incorporación de un grupo metil en un carbón del nucleótido)



los promotores son ricos en islas CpG

5-Methylcytosine se produce al reaccionar DNA methyltransferases (DNMT 1, 3a or 3b), que cataliza la transferencia de un grupo metilo (CH3) desde S-adenosylmethionine (SAM) al carbón 5 de la citosina (¿como sabe esa enzima que genes metilar y cuales no?)

Estas islas metilada son susceptibles de ligarse a proteínas ( por ejemplo MECP2 "methyl CpG-binding protein 2 )


Dnmt3a y Dnmt3b dan metilaciones de novo

Dnmt1 al dividirse el dna produce una nueva metilación en la hebra hija

La Demethylation ocurre en ausencia de Dnmt1 with continued rounds of DNA replication (passive demethylation), as well as actively (without DNA replication). The nature of demethylases is unknown.

DNMT3L asiste a las metilaciones de novo
Entre el 60 y 90% de las cpg se mutilan (cosa rara los de imprintin son pocos) (¿Hay polimorfosmos en los imprinting genes?)
La metilación la hacen DNMT1, DNMT3a, DNMT3b DNMT3a y DNMT3b parecen ser las que dan patrones de metilacion en el embrion temprano ¿pero por que a ciertos genes y no a otros, ¿Cómo escogen los gene a mutilar?
¿Quizas la actividad de un gen lo hace metilable o al revés?
DNMT1 es la que mantiene ese patrón de célula madre a hija (ambas copias)
La metilación no siempre es silenciamiento
La metilación cambia estructura de cromatina
Un patrón de metilación es el resultado de:
1.- d e novo mutilaciones
2.- mantenimiento
3.- desmetilacion
(Paolini 2004)

En general los genes expresados en el imprinting paterno elevan el desarrollo fetal mientras que la maternal lo limita.
(Paolini 2004)


MASH2 regula el desarrollo de spongiotrophoblast

Igf2 se ha encontrado en labyrinthine trophoblast

ASCL2 se expresa en spongiotrophoblast y labyrinthine
(se debería estudiar lo abortos de icsi y de art para ver como estan epigeneticamente)


3.4 ¿CÓMO SABE QUE GENES MODIFICAR Y CUALES NO?
Se desconoce

3.5 ¿HAY UNA LLAVE MAESTRA O CADA UNO OBEDECE A UN FENÓMENO INDEPENDIENTE?

3.6 ¿CUAL ES LA CAUSA NO CAUSADA DEL IMPRINTING?

La expresion del gen KCNQ1OT1 del cromosoma 11p15.5, es esencial para el imprinting de ciertas regiones. El mecanismo puede ser un gen se activa en un entorno digamos ovárico o espermático y este produce el imprinting
Estudiando sus factores de transcricion se podría lograr saber cual la causa primera del imprinting
IGF2

H19

19q13.4
IGF2

H19

19q13.4

intergenic germline-derived differentially methylated region (IG-DMR) ES CANDIDATOPARA REGION CONTROL DEL CROMOSOMA 12
Es un cluster que contiene:
paternally expressed protein-coding genes Dlk1 y Dio3 y varios non-coding RNAs, de expression maternal incluido Gtl2 y C/D snoRNAs.

A retrotransposon-like gene (Rtl1) is expressed from the paternal chromosome and has an antisense transcript expressed from the maternal chromosome containing two microRNAs with full complementarity to Rtl1

Deleccion de IG-DMR del cromosoma materno causa la perdida del imprinting en todos los genes del cluster
La delección paterna deja intacto el imprinting
Unas mujeres carecen de un pedazo de cromosoma: 19q13.4
ese gen sano feminizaría óvulos.
Podría feminizar los espermatozoides

4 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA.
No se sabe como y que factores determinan el imprinting humano. Numerosas aplicaciones se pueden derivar de su conocimiento.

5.- JUSTIFICACION

1.- La impronta genética es un requisito para el desarrollo normal de los embriones
Esta se realiza en la línea germinal
Su error debe llevar errores que impiden el desarrollo exitoso de los embriones.
En especial en aquellos procedimientos como el ICSI que aceleran los procesos epignéticos en el gameto masculino.
Se ha demostrado mayor porcentaje de enfermedades epigenéticas en paciente de niños de ICSI
Se han encontradon defectos en la methylation de H19 y MEST EN OLIGOZOSPERMICOS (C.J. Marques 2008) Esto podría explicar la aparición del Silver–Russell syndrome en niños con H19 hypomethylation nacidos de ART. (C.J. Marques 2008)

Ademas una baja unmethylation of the CTCF-binding site could lead to inactivation of the paternal IGF2 gene, and be linked to decreased embryo quality and birth weight, often associated with ART. (C.J. Marques 2008)

2.- Imrpinting es un límite a la clonación pues no hay tiempo de un correcto reprogramación

3.- nuevos medicamentos

4.- ingeniería epigenética

6 ANTECEDENTES DEL PROBLEMA

6.1.- EXPERIMENTO DE 2 MADRES

El CIGOTO lo hicieron con un genoma maduro y otro inmaduro (Tomohiro Kono 2004) º El ocito no desarrollado era de un raton mutante con una deleccion de 13-kilobases
La metilacion materna ocurre en la maduracion del oocito
El no desarrollado es (ng)
Y el desarrollado (fg)
Pero en el ng no se altero H19 y Igf2
Para bloquear H19 en ng se uso un raton con una delecion en ese gen
Los embriones nacieron a los 17.5 dias
Se confirmo que estos embriones no pasan del dia 17.5
Los 2 nacieron con cresimiento retardado tenian un higado poco desarrollado
Igf2 y H19 Asi como Dlk1 y Gtl2 Son impresos en la espermatogenesis.
Si se logra la expresión correcta de igf2 y de ha19 un numero amplio de otros genes se pone bien (ósea de materno pasa a paterno)
De este experiemento se puede deducir las siguientes cosas:

-Se puede concluir que un ovocito inmaduro es como un espermatozoide excepto por 2 genes (igf2 y h19)
-Se anulo uno de ellos (h19)para conseguir el espermatozoide
-Un espermatozoide es como un ovocito inmaduro excepto por 2 genes
-Si se agrega los factores de maduración del ovulo y se anula igf2 podría conseguir un ovulo completo

6.2.- Experimento de modificacion artificial del imprinting

MODIFICACION ARTIFICIAL DEL IMPRINTING
synthetic estrogen, diethylstilbestrol (DES) can developmentally imprint genes by changing the pattern of DNA methylation.( John A. McLachlan, 2001)
Los hijos del ICSI pesan menos (Paolini 2004)
La exreecion de los genes impresos y el desarrollo del feto es influenciada por la adicion de suero fetal de ternera al medio de cultivo (Paolini 2004)

No se sabe como este medio afecta el imprinting
Quizas remuebe los grupos metilos, llevando a incompletar o a borrar el patrón de imprinting. (Paolini 2004)


al parecer pesan menos ivf, eso habla de que ganan los genes maternos osea que los genes paternos están incompletos

6.3.- Experimento del espermatozoide femenino

EXPERIMENTO DEL ESPERMATOZOIDE FEMENINO
Primero Células madre se convirtieron en esperamtozoides que preñaron
(Nayernia K 2006)

Células de medula se trasformaron en células germinales masculinas hubo expresión de marcadores de células germinales (Nayernia K. 2007)
El ratón nacido tenia defectos y se usos químicos especiales y vitaminas

6.4.- Mujer productora de ovulos

Hay un locus para molas 19q13.4. Examinaron la metilación en las hijas y en la mola
Usaron los dos bisulfite-based methods(¿??)
La mutación se heredo del abuelo o la abuelo materno por lo que se concluye que el error no se debe a un borrada de las marcas de imprinting si no mas bien al reestablecimiento de marcas maternas en la ovogénesis o en su post-cigotic mantenimiento (El-Maarri O 2003)
Si hay una mutación que convierte el geneoma materno en paterno:
1.- Un elemento simple determina la paternidad o maternidad del genoma
2.-ese gen sano feminizaría los espermatozoides.
3.- la partenisación del genoma require la no activación o la supresión de ese gen.
El estado normal quizás es paterno

Primero hay que borrar y después imprimir

Estudiar los dos estapas, la de borrado y la de impresión
Y recrear su situcion o su causa y asi hacelo enlab
Monitoreandocon pcr impronting

7 HIPOTESIS

El factor de desarrollo folicular además de un silenciamiento del gen igf2 puede cambiar el imprinting paterno de los espermatozoides a materno


MATERIALES Y METODOS

CRONOGRAMA

1.-leer too sobre causa y efectos del imprinting humano

2.-Aislar adn de espermatozoides y que sobreviva el imprinting a el

3.-establecer técnica para verificar el estado de metilacion en genes o de imprinting

4.- modificar experiementalmente el imprinting y verificarlo

5. averiguar que causa el imprinting materno y paterno

6.- logra fecundación en animales


III.-METODOLOGÍA.

Usaron la tecnica : bisulphite genomic sequencing. (C.J. Marques 2008)







BIBLIOGRAFIA


Arie Mira l1, Edward Robinson2, John R. McCarrey2 & Howard Gamete−specific methylation correlates with imprinting of the murine Xist gene Nature Genetics 9, 312 - 315 (1995)

Arie Mira l1, Edward Robinson2, John R. McCarrey2 & Howard Cedar1 Gamete−specific methylation correlates with imprinting of the murine Xist gene Nature Genetics 9, 312 - 315 (1995)


El-Maarri O, Seoud M, Coullin P, Herbiniaux U, Oldenburg J, Rouleau G, Slim R Maternal alleles acquiring paternal methylation patterns in biparental complete hydatidiform moles Hum Mol Genet 2003; 12:1405-13
2003




El-Maarri O, Slim R Familial hydatidiform molar pregnancy: the germline imprinting defect hypothesis? Curr Top Microbiol Immunol 2006; 301:229-41 2006

Horsthemke, B Gerald F. Bai-Lin Wu,1,2 and Bernhard Horsthemke5Charité, Am J Hum Genet. 2002 July; 71(1): 162–164. Intracytoplasmic Sperm Injection May Increase the Risk of Imprinting Defects


Kaomei Guan1,4, Karim Nayernia2,4, Lars S. Maier1, Stefan Wagner1, Ralf Dressel3, Jae Ho Lee2, Jessica Nolte2, Frieder Wolf1, Manyu Li2, Wolfgang Engel2 & Gerd Hasenfuss Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis Nature 440, 1199-1203 (27 April 2006) 2006


Kierszenbaum AL. Genomic imprinting and epigenetic reprogramming: unearthing the garden of forking paths. 2002
Mol Reprod Dev. 2002 Nov;63(3):269-72.

Lin SP, Youngson N, Takada S, Seitz H, Reik W, Paulsen M, Cavaille J, Ferguson-Smith AC. Asymmetric regulation of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at the Dlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12. 2003Nat Genet. 2003 Sep;35(1):11-2.

Luedi, P.P et al. Computational and experimental identification of novel human imprinted genes. (2007) Genome Res 17:1723-1730].

Manning Martina a, Willy Lissensb, Wolfgang Weidnera, Inge Liebaersb DNA Methylation Analysis in Immature Testicular Sperm Cells at Different Developmental Stages
Vol. 67, No. 2, 2001
MANNING Martina; LISSENS Willy ; LIEBAERS Inge ; VAN STEIR TEGHEM André ; WEIDNER Wolfgang ; Imprinting analysis in spermatozoa prepared for intracytoplasmic sperm injection (ICSI) International journal of andrology
2001, vol. 24, no2, pp. 87-94 (17 ref.)


McLachlan John A. , Mathew Burow, Tung-Chin Chiang and Shaun Fang Li
Gene imprinting in developmental toxicology: a possible interface between physiology and pathology 2001 Toxicology Letters
Volume 120, Issues 1-3, 31 March 2001, Pages 161-164



Marques C.J. 1, P. Costa1, B. Vaz1, F. Carvalho1, S. Fernandes1, A. Barros1,2 and M. Sousa Abnormal methylation of imprinted genes in human sperm is associated with oligozoospermia2008 Molecular Human Reproduction 2008 14(2):67-74;


Nayernia K. Drusenheimer N, Wulf G, Nolte J, Lee JH, Dev A, Dressel R, Gromoll J, Schmidtke J, Engel W, Putative human male germ cells from bone marrow stem cells. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;63:69-76.


Nayernia K., Lee J.H., Drusenheimer N., Nolte J., Wulf G., Schwandt I., Ralf D., Müller C.H., Gromoll J., Engel W. Derivation of germ cells from bone marrow stem cells. Lab Invest Volume: 86 Pagination: 654-6632006

Nayernia K, Vauti F, Meinhardt A, Cadenas C, Schweyer S, Meyer BI, Schwandt I, Chowdhury K, Engel W, Arnold HH. Inactivation of a testis-specific Lis1 transcript in mice prevents spermatid differentiation and causes male infertility.
J Biol Chem. 2003 Nov 28;278(48):48377-85. Epub 2003 Sep 16.

Nayernia K.Lee J.H., Engel W., Stem Cell Protein Piwil2 Modulates Expression of Murine Spermatogonial Stem Cell Specific Genes.
Mol Reprod Dev. Volume: 73 Number: 2 Pagination: 173-1792006

Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW, Lee JH, Rathsack K, Drusenheimer N, Dev A, Wulf G, Ehrmann IE, Elliott DJ, Okpanyi V, Zechner U, Haaf T, Meinhardt A, Engel W.In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice. Dev Cell. 2006 Jul;11(1):125-32


Nayernia K, Lee JH, Drusenheimer N, Nolte J, Wulf G, Dressel R, Gromoll J, Engel W.Derivation of male germ cells from bone marrow stem cells.
Lab Invest. 2006 Jul;86(7):654-63. Epub 2006 May 1.

Paoloni Ariane -Giacobino1 and J Richard Chaillet Genomic imprinting and assisted reproduction Reprod Health v.1; 2004


Saiti Deshira and Orly Lacham-Kaplan Mouse Germ Cell Development in-vivo and in-vitro Tomohiro Kono1,3, Yayoi Obata1,3,
Quiong Wu1,3, Katsutoshi Niwa1,3,Yukiko Ono1, Yuji Yamamoto2,3, Eun
Sung Park4, Jeong-Sun Seo4,5& Hidehiko Ogawa1,3 Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood2004 NATURE | VOL 428 | 22 APRIL 2004


Webber Andrea L. 1, Robert S. Ingram1, John M. Levorse1 and Shirley M. Tilghman1 Location of enhancers is essential for the imprinting of H19 and Igf2 genes199Nature 391, 711-715 (12 February



Yasuhide Ohinata1,7, Bernhard Payer2,7, Dónal O'Carroll3,7, Katia Ancelin2, Yukiko Ono1, Mitsue Sano1, Sheila C. Barton2, Tetyana Obukhanych4, Michel Nussenzweig4, Alexander Tarakhovsky3, Mitinori Saitou1,5,6 & M. Azim Surani2 Blimp1 is a critical determinant of the germ cell lineage in mice2005 Nature 436, 207-213 (14 July
2005)